拿到代谢组学数据后，应该先看什么？怎样判断数据是否可靠？如何从差异代谢物中找到真正值得验证的候选分子？学霸菌一篇搞定：代谢组学的理论基础、实验设计、分析流程以及如何在课题中应用。
图 1：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/2025715321185609569
通俗地说，代谢组学经常被用于以下问题的探究：
• 疾病状态下哪些代谢过程发生改变？
• 药物是否纠正了异常代谢？
• 哪些代谢物可以作为诊断或疗效预测标志物？
• 某个基因或蛋白如何影响细胞代谢？
• 肿瘤细胞与免疫细胞之间是否存在代谢竞争或代谢物通讯？
因代谢物水平受到饮食、时间、药物、菌群和样本处理等多种因素影响，所以代谢组学对实验设计和质量控制的要求非常高。
非靶向与靶向代谢组学有什么区别？
1、非靶向代谢组学
非靶向代谢组学尽可能广泛地检测样本中的代谢特征，适合用于发现未知变化和筛选候选代谢物。其优势是检测范围广，适合探索；不足是部分信号只能完成初步注释，定量结果通常属于相对定量。
2、靶向代谢组学
靶向代谢组学针对预先确定的一组代谢物进行检测，通常使用标准品和标准曲线进行定性、定量。其优势是准确度、灵敏度和重复性较高，适合验证候选代谢物；不足是检测范围相对有限，难以发现预设范围以外的变化。实际研究中，常见策略是：先通过非靶向代谢组学发现候选代谢物，再采用靶向代谢组学进行独立验证。
3、样本的制备标准
4、代谢组学检测技术与流程
目前代谢组学检测技术包括 NMR、GC-MS、LC-MS 等
核磁共振波谱（NMR）：能够无损检测代谢物的结构信息，但灵敏度较低。
气相色谱-质谱（GC-MS）：灵敏度高，适用于挥发性代谢物的定量分析。
液相色谱-质谱（LC-MS）：广泛应用于多种类型的代谢物检测，具有高灵敏度和高通量的特点。
图 2：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/29489771？from_voters_page=true
如何筛选差异代谢物？
常用的多元统计分析方法包括：
主成分分析（PCA）：用于降维和揭示数据中最大的变异方向。
偏最小二乘判别分析（PLS-DA）：用于找到实验组间的差异代谢物。
常见筛选指标包括：
Fold change；P 值；FDR 或校正后 P 值；VIP 值；代谢物鉴定可信度；QC 中的稳定性。
VIP 来自 PLS-DA 模型，用于评价某个变量对分组区分的贡献。常见筛选条件是 VIP＞1，但 VIP 高不等于该代谢物一定具有生物学意义。
差异代谢物可以用哪些图展示？
1、火山图：展示整体差异
横轴表示 log₂FC；纵轴表示−log₁₀P 值或−log₁₀FDR；
右侧为升高的代谢物；左侧为降低的代谢物。
图中可以重点标注与研究方向相关、鉴定证据较可靠并准备后续验证的代谢物。
图 3：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/28690644158
2、热图：观察样本中的表达模式
热图可以展示候选代谢物在每个样本中的相对丰度。
主要观察：
• 同组样本是否表现出相似模式；
• 不同组之间是否存在一致变化；
• 差异是否由个别异常样本推动；
• 候选代谢物之间是否形成不同变化模块。
热图一般使用标准化后的 Z-score。颜色反映的是某个代谢物在不同样本中的相对高低，不能直接比较不同代谢物的绝对含量。
图 4：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/346138512
差异代谢物关联热图：解析不同分子间的协同调节规律。通过 Pearson 算法量化代谢物两两之间的线性相关程度（正相关趋于 1，负相关趋于 -1），并结合显著性检验，从而辅助识别处于同一通路或存在上下游调控关系的代谢物功能簇。
图 5：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/28690644158
图中纵坐标和斜纵坐标代表差异代谢物的名称，颜色代表相关性，红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色越深相关性越高。
3、箱线图或散点图：展示单个候选物
单个代谢物建议使用箱线图、小提琴图或散点图，并显示每个生物学重复。
相比只展示均值的柱状图，这类图可以更加直观地反映：
• 组内变异；
• 样本量；
• 离群值；
• 组间重叠程度
图 6：https：//biotree.biomart.cn/news/2972457.htm
图 7：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/586620162
4、ROC 曲线：评估标志物能力
如果研究目标是筛选诊断或疗效预测标志物，可以绘制 ROC 曲线，并计算曲线下面积 AUC。
但同一队列中完成候选物筛选和 ROC 评价，容易高估性能。较可靠的研究还需要：
• 独立验证队列；
• 交叉验证；
• 与现有临床指标比较；
• 校正年龄、性别、分期等混杂因素；
• 多代谢物模型的过拟合评估。
图 8：https：//blog.51cto.com/u_15668923/5350438
怎样从代谢物变化走向代谢通路？
单个代谢物通常同时参与多条通路，因此不能只根据一个代谢物升高，就判断整条通路被激活。
常见分析包括：KEGG 通路富集；代谢通路拓扑分析；代谢物集合富集分析；代谢网络分析；与基因和蛋白数据联合分析。
解释通路时，应进一步分析：
命中了多少个代谢物；
代谢物变化方向是否一致；
是否存在关键中间产物或终产物；
上下游代谢物之间能否形成合理链条；
相应代谢酶和转运体是否发生变化；
是否有靶向定量或功能实验支持。
例如，乳酸升高可能来自生成增加，也可能来自利用下降或外排障碍。仅凭终产物浓度，通常无法判断代谢通量方向。
图 9：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/546286354
为系统阐明基因、酶与代谢物之间的级联调控机制，研究中常利用 MetScape 软件整合差异表达基因与差异代谢物，构建了多组学交互调控网络。在拓扑结构中，节点度（连接数）直观反映各分子的交互广泛度，高度连接的节点提示其处于网络枢纽（Hub）地位。
如下图：六边形代表代谢物，圆形代表基因，正方形代表催化酶，菱形代表生化反应过程；节点几何尺寸映射其表达量/丰度的差异变化倍数（上调或下调幅度），绿色外边框则高亮标识出具有统计学显著性的关键分子。
图 10：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/680685984
代谢组怎样与转录组和蛋白组联合？
代谢物是代谢反应的结果，而基因和蛋白可以帮助解释这种变化可能由哪些酶或转运体驱动。
例如：某脂肪酸升高→ 脂肪酸合成酶表达增加→ 脂肪酸氧化相关蛋白降低→ 同位素示踪证实脂质合成通量增加。
常见联合分析方法包括：
• 差异代谢物与差异基因共同通路分析；
• 代谢物—酶—基因网络；
• 代谢物与基因表达相关性分析；
• 转录因子—代谢酶—代谢物调控网络；
• 多组学聚类和机器学习模型。
需要注意，mRNA 升高不一定意味着酶活性增加。酶活性还受到蛋白丰度、磷酸化、底物浓度、辅酶供应和亚细胞定位等因素影响。
因此，多组学联合的目的不是简单取交集，而是建立可以实验验证的生物学关系。